三种植物源杀虫活性成分对东方粘虫中肠细胞的毒力测定

　　摘　要　采用MTr([3—(4，5—二甲基噻唑—2)—2，5—二苯基]四氮唑溴盐)比色法、中性红摄取法和台盼蓝拒染法，分别测定技术已经日臻成熟，利用昆虫细胞来检测药物活性的离体测试体系也逐步发展起来。
　　苦皮藤素V是从卫矛科植物苦皮藤中分离的一种二氢沉香呋喃多元酯类化合物，研究表明它对鳞翅目许多作物害虫具有毒杀作用；白鲜碱和棒皮酮是从芸香科植物白鲜中分离到的2种化合物，关于这2种化合物的杀虫活性已有报道。
　　本文分别采用MTY比色法、中性红摄取法和台盼蓝拒染法测定了3种植物源杀虫活性物质苦皮藤素V、白鲜碱和梣皮酮对东方粘虫中肠细胞的毒力作用，以期为以后的植物源杀虫活性成分微量测定提供一些思路。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1.1　培养基
　　昆虫细胞培养基：Grace’s培养基(gibic01)补加10％胎牛血清(gibic01)。
　　
　　1.2　供试昆虫
　　东方粘虫Mythimna separata Walker，由西北农林科技大学农药研究所提供。
　　
　　1.3　供试药剂
　　苦皮藤素V、白鲜碱和梣皮酮。纯度均在97％以上，由西北农林科技大学农药研究所提供。
　　
　　1.4　试验方法
　　1.4.1　东方粘虫中肠细胞的急性分离与培养：取生理状态一致的初蜕东方粘虫6龄幼虫，于直径6cm培养皿中饥饿24h，用2％NaCIO溶液浸泡8min，再用75％的酒精体表消毒8min，无菌0.01mol／L磷酸盐缓冲液(PBs，pH=7.4)清洗3次，解剖取其中肠组织，在显微镜下剔除其它附着物，再用PBS冲洗数遍后，用无菌眼科剪将中肠剪碎，离心后加入少量PBS，用手指稍用力弹击离心管底，使细胞充分悬浮并从底膜上脱落分散，离心收获细胞，用Grace’s昆虫培养基于28℃下培养待用。
　　1.4.2　MTY比色法测定细胞毒性
　　参照周青春、毛黎娟等的方法并有所改动。将培养的中肠细胞于1000 r／min离心后，用无血清培养基稀释成3.0×lO⁵～5.0×10⁵cell／mL的细胞悬液，取一定量的细胞悬液，向其加入一定量的MTT母液(5mg／mLMTT溶液)，培养4h后，取0.5mL作为对照，其余的分成3份，分别加入细胞裂解液二甲亚砜、酸化异丙醇溶液(pH=4.5)和10％SDS溶液(pH=4.5)溶解甲媵结晶，取溶解液的上清液在UV一2550分光光度仪(sHIMADZU)上400～700 nln范围内连续扫描，以确定甲媵结晶溶解液的最大吸收波长。将制备好的细胞悬液接种在96孔细胞培养板的第2～8行，每孔加入量为100μL。28℃培养24h后，第1行加入培养基作调零用，第2行加入含1％二甲亚砜的培养基作对照，其他各行依次加入不同浓度梯度的药液。每浓度梯度6孔，加入量为每孔100μL，加完后于28℃下继续培养24h。在培养结束前向每孔加入MTT母液使其终浓度为0.5mg／mL，继续培养4h后，向每孔加入100μL细胞裂解液二甲亚砜。待蓝紫色甲臜结晶物完全溶解后，置于MK-3酶标仪(thermo)上在492nm下读取OD值，每一浓度的OD值均为6孔的平均值。将得到的OD值按如下公式换算成细胞抑制率:细胞抑制率(％)=对照孔的平均OD值-处理孔的平均OD值/对照组的平均OD值×100％。
　　1.4.3　中性红摄取法测定细胞毒性：参照张卓然的方法并有所改动。将制备好的细胞悬液接种在96孔细胞培养板上，每孔接种量为100μL，28℃培养24h后，第1行不加药剂作对照，第2～8行加入依次加入不同浓度梯度的药液。每浓度梯度6孔，加入量为每孔100μL，加完后于28℃下继续培养24h，在培养结束后，轻轻倒掉培养基并用PBS清洗3次，加入100μL的中性红溶液继续培养3h后倒掉中性红溶液，再用PBS清洗3次，加入200μL中性红细胞固定液(各含1％的乙酸与甲醛的水溶液)固定5min后倒掉固定液，再加入100μL中性红提取液(含1％乙酸与50％乙醇的水溶液)，置于酶标仪上在570nm下测定OD值，将读取的OD值按如下公式换算成中性红相对摄取率:中性红相对摄取率(％)=受试药物组吸光指/对照组吸光值×100％。
　　1.4.4　台盼篮拒染法:将制备好的细胞悬液接种在96孔细胞培养板上，每孔接种量为100μL，28℃培养24h后，第1行不加药剂作对照，第2～8行由低向高依次加入不同浓度梯度的供试药液。每浓度梯度6孔，加入量为每孔100μL，加完后于28℃下继续培养24h，在培养结束后，每孔加入50μL0.3％台盼蓝溶液混匀，染色3～5min后，血球计数板计数，记录每孔中活细胞的数目，按下列公式计算细胞死亡率:细胞死亡率(％)=1-未蓝染细胞数字/对照组细胞数×100％。
　　
　　2　结果与分析
　　
　　2.1　东方粘虫中肠细胞的急性分离与培养
　　急性分离到的中肠细胞在培养3d后，未从底膜上游离出来的细胞逐渐游离出来，而单细胞开始疏松贴壁，经2～3次更换培养基后，死亡的细胞通过换液逐渐被换掉，活细胞疏松切壁，以后每隔7d半量更换培养基，分离的细胞处于原代培养阶段。
　　
　　2.2　MTT比色法测试波长的确定
　　用3种裂解液溶解甲媵结晶，取上清液在UV-2550分光光度仪上400～700nm连续范围内连续扫描，得到吸收光谱曲线(见图1)。
　　
从图1中可以看出：酸化异丙醇溶解甲臜结晶所得到的上清液的吸收曲线(b)在558nm处有最大吸收值0.392，10％SDS溶解甲媵结晶的上清液的吸收曲线(c)在568 nm处有最大吸收值0.498，二甲亚砜溶解甲臜结晶得到的上清液的吸收曲线(d)在485～570 am之间的吸收值变化范围在0.642～0.651之间，在497nm处有最大值为0.651，对照组的吸收曲线(a)在480～700nm范围内无显著的变化，说明残留的MTF和培养基对上述上清液的0D值影响可以忽略不计，因此，在毒力测定中，本实验选二甲臜砜为甲臜结晶裂解液，选492nm作为酶标仪的测试波长是合适的。DPS数据处理系统处理，求得毒力回归方程和致死中浓度(Lc₅₀)，结果见表1。
　　
　　2.3　三种植物源活性物质对粘虫中肠细胞的毒力
　　利用MTr比色法、中性红摄取法和台盼蓝拒染法分别测得了苦皮藤素V、白鲜碱和臜皮酮对粘虫中肠细胞的毒力。在实验过程中，根据试验预试，将供试化合物苦皮藤素V用二甲亚砜稀释成2，5，10，15和20μL／mL；白鲜碱稀释成10，20，30，40和50μL／mL；臌皮酮稀释成

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