植物油沥青中总甾醇的分析

　　引言
　　
　　种子中，是植物体内构成细胞膜的成分之一，也是多种激素及甾族化合物生物合成的前体，通过研究发现，植物甾醇和甾醇酯在动物体内的作用和胆固醇相当，特别是植物甾醇酯比植物甾醇具有更佳的脂溶性，FDA已认定植物甾醇酯为GRAS(一般认为安全)产品，临床观察发现，它有明显的降血脂作用。
　　植物油沥青是植物油皂脚经皂化、酸解、精馏分出各种脂肪酸后的残留物，沸点高、颜色深、成分复杂，目前主要采用焚烧处理，没有得到充分利用，经对植物油沥青提取物的GC-MS分析可知，其中含有一定量甾醇，主要由谷甾醇、谷甾醇、菜油甾醇等组成。
　　甾醇和甾醇酯的分析方法主要有毛地黄皂苷法、Lieberman-Burchard比色法、薄层扫描法、气相色谱分析、高效液相色谱分析、液相色谱分析、紫外分光光度法等，上述各种方法主要用于样品颜色较浅的体系分析，有关植物油沥青中甾醇含量的分析研究未见报道，本文针对植物油沥青样品的特点，采用改进的Lieberman-Burchard比色法，以不加显色剂的样品溶液作空白，建立了测定植物油沥青中总甾醇含量的方法，取得了较为满意的结果。
　　
　　1、材料与方法
　　
　　1、1原料试剂
　　植物油沥青：江苏永林油脂有限公司提供，以植物油脚为原料制得。
　　甾醇标准液：准确称取卢一谷甾醇标准品50mg，置于50mL小烧杯中，加少量乙酸酐于60℃水浴中溶解，转移人50mL容量瓶中，加乙酸酐至刻度，浓度为1.00mg/mL。
　　沥青样品液：准确称取65 mg植物油沥青于50mL小烧杯中，加少量乙酸酐于60℃水浴中溶解，转移人50mL容量瓶中，加乙酸酐至刻度，浓度为1.30mg/mL。
　　甾醇样品溶液：准确称取52.2mg甾醇样品(植物油沥青经提取得到)置于50mL烧杯中，加少量乙酸酐于60℃水浴中溶解，转移人50mL容量瓶中，加乙酸酐至刻度，浓度为1.04mg/mL。
　　正己烷、乙醇、乙酸酐、硫酸等为分析纯，谷甾醇由Fluka Chemie GmbH提供。
　　1、2主要仪器 722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，
　　1、3方法
　　(1)甾醇样品制备将植物油沥青用碱先进行皂化，然后用异丙醇和苛性钾醇解，得到的反应液放置冰箱中冷却，析出粗甾醇制品。
　　(2)序一谷甾醇标准曲线的制作，用移液管分别准确移取0.3、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL标准溶液于10mL容量瓶中，用乙酸酐稀释至刻线，其浓度分别为0.030、0.50、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500mg/mL，然后分别加入10滴浓硫酸于容量瓶中，显色10 min，在660 nm下用分光光度计分别测定其吸光度A，以谷甾醇量为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
　　(3)样品中总甾醇含量测定，准确移取2.0mL配制好的沥青溶液和甾醇样品溶液分别于10mL容量瓶中，用乙酸酐定容，加入10滴浓硫酸，溶液颜色由无色经红色变成暗绿色，稳定10min后用分光光度计在660nm处测其吸光度，由回归曲线方程计算样品中总甾醇的含量。
　　
　　2、结果与讨论
　　
　　2、1体系最大吸收波长的确定
　　将谷甾醇标准溶液稀释10倍，于600～710 nm范围内测定吸光度，得到口一谷甾醇吸收曲线，以确定最大吸收波长，可以看出，在660 nm处有最大吸收峰，实验选择660 nm作为测定吸收波长，并且在此波长范围内用样品的基质溶液作空白对样品的测定没有影响。
　　2、2显色时间的选择
　　准确移取标准溶液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加乙酸酐稀释至刻度，摇匀，加入10滴浓硫酸，颜色由无色经红色最后变成深绿色，考查显色时间的不同，得到的吸光度。
　　2、3标准曲线
　　按1.3中标准曲线制作方法绘制标准曲线如图2所示，计算其回归方程为：y＝1.705x-0.005 53，相关系数r＝0.99908，结果表明在0.030—0.300mg/mL范围内，线性良好，符合比尔定律。
　　2、4未知样品总甾醇含量测定
　　分别准确移取甾醇样品溶液、沥青样品溶液各2.00 mL于10mL容量瓶中，测定其吸光度，根据回归方程计算各自样品的甾醇含量(以口一谷甾醇计)。
　　2、5回收率试验
　　分别准确吸取甾醇样品溶液、沥青样品溶液各2.00 mL于6只10mL容量瓶中，其中3只容量瓶中加入甾醇标样1.00mL，按1.3中含量测定方法测定吸光度，由回归曲线求出总甾醇含量，计算回收率。
　　
　　3、结论
　　
　　(1)通过分析可以看出，分光光度法测定沥青中总甾醇含量，样品的呈色反应明显，显色稳定时间达20min，以不加显色剂的样品溶液作空白，能得到较好的精密度和回收率，该方法操作简单，检验费用低，适合企业化验室快速检验，以便及时调整工艺，使产品稳定生产。
　　(2)由分光光度测定得知，植物油沥青中总甾醇含量达到12.1％，提取物中甾醇含量为74.5％，
　　(3)采用改进的Lieberman-Burehard的分光光度法测定样品中甾醇含量，相对标准偏差为0.0603％-0.216％，回收率为94.8％-98.1％，证明此方法准确、可靠。
　　(4)分光光度法测定植物油沥青的甾醇含量，对植物油沥青中高附加值组分的开发应用能够提供参考。